DNA鉴定之高分辨率熔解技术

       高分辨率熔解技术(high resolution melting，HRM)仅仅通过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR片段的微小序列差异，从而应甩于突变扫描、序 列配对和基因分型等多个方面(Liu et al一2010)。双链D\A的熔解分析可追溯到20世纪60年代，当时是通过紫外吸收来监测的。分析需要几微克的DNA，而样品以(0.1～1.0)℃／min的速率缓慢加热，常常要花上几个小时才能完成：后来，LightCycler定量PCR仪的出现，让荧光熔解分析变得流行：样品量因毛细管而缩减至纳克级，且熔解速率更快，达(0.1～1.0)℃/S，熔解时间缩短至几分钟，当时使用的染料是SYBR Green I。然而，这种熔解分析只能区分在片段大小和GC含量上差别较显著的DNA序列，如检查PCR扩增产物中是否存在引物二聚体及其他非特异性的扩增。如果要区分SNP，分辨率还不够。SYBR Green I属于非饱和性染料，由于它对PCR的抑制作用，在实验中的使用浓度很低，远未将DNA双螺旋结构中的小沟饱和。这样，DNA双链高温变性时，单链部分的荧光染料分子发生重排，荧光染料分子重新结合到双链DNA的空置位点，造成荧光信号没有变化，因此出现假阴性，特异性下降。而饱和染料即便在饱和浓度（荧光最大）下，也不会抑制PCR，故高浓度的染料饱和了DNA双螺旋结构中的小沟，在DNA觯链过程中就不会发生重排，这样熔解曲线才有了更高的分辨率。目前市场上的饱和染料主要有LC Green、LC G，een Plus等几种。
      扩增子的熔解曲线完全取决于DNA碱基序列。序列中如有一个碱基发生了突变，就会改变DNA链的解链温度，但是这个差异极小，只有零点几摄氏度，如果仪器的分辨率不高，是根本无法检测的。那么什么样的分辨率才是高分辨率呢？根据仪器现有的功能测试，在熔解操作时每摄氏度至少要获得10个数据点，这是对仪器的最低要求。此外，温度均一性也同样重要。如果两孔之间温度相差0.1℃，就很可能导致最终的熔解温度相差0.1℃，这样就无法保证HRM分析结果的准确性。大多数常规定量PCR仪的孔间温度差为0.3～0.5℃，这也决定了它们无法胜任HRM。
      目前市场上有多个厂家提供HRM分析的仪器，包括Idaho Technology、Corbett (QIAGEN)、Roche等，有些是专供HRM的仪器，有些则是附带HRM功能的定量PCR仪。在拥有饱和染料和高分辨率仪器之后，HRM分析过程其实很简单，就是对PCR的扩增子进行加热，温度从50℃逐渐上升到95℃。在此过程中，扩增子逐渐解链，在到达熔解温庋(L)时，DNA链完全分开。在HRM分析的初期，荧光强度很高，随着温度升高，双链DNA逐渐减少，荧光强度也就随之下降了。HRM仪器通过照相机记录下荧光变化的整个过程。通过对数据进行作图，就生成了熔解曲线。
      综上所述，HRM技术应用广泛，操作简单又经济，结果精确且可靠，适合任何实验室使用。市场上有一些专供HRM分析的仪器，不过，那些带有HRM功能的定量PCR仪则更实用。QIAGEN的Rotor-Gene Q(Corbett Rotor-Gene 6000)就是全球第一台将实时扩增与HRM分析技术相结合的实时荧光定量分析装置。Rotor-Gene Q的温度均一性为0.01℃，解决了温度均一性，精确性和分辨率的问题，实现了定量扩增与HRM的合二为一。