亲子鉴定的第一步就是样本的DNA提取。DNA提取有哪些方法呢?DNA提取通常有三种提取方式:手工提取、半自动提取(代替手工提取中的一些步骤)和全自动提取(无需手工,放入检材,取出提取好的DNA进行扩增)。
一、手工提取
1.Chelex-100提取法:Chelex-100是一种化学鳌合树脂,由苯乙烯.二乙烯苯共聚体组成。其中含有的选择性螯合二价离子,比普通离子交换剂具有更高的金属离子选择性和较强的结合力,能结合许多可能影响下一步分析的其他外源物质。通过离心除去Chelex颗粒,使与Chelex-100结合的物质与DNA分离,防止DNA降解。
2.有机提取法:即经典的饱和酚-氯仿法。它利用有机的蛋白质变性剂酚、氯仿交替抽提,使蛋白质变性,有效地去除蛋白质等杂质。有机提取法能获得较多的大片段DNA,比Chelex-100提取方法能更彻底地纯化DNA。
3.无机提取法:利用6mol·L-1 NaCl或醋酸钠沉淀蛋白质代替有机酚-氯仿抽提步骤去除蛋白质,其他过程同有机溶剂提取法。
4.差异裂解法:主要用于混合精斑中的精子DNA提取。依据精子细胞膜和核膜含有大量硫醇蛋白,含有丰富的二硫键,利用这一特性可将罪犯和受害人的DNA分析分开,便于最后结果解释。
5.磁珠提取法:利用磁性硅胶吸附白细胞,用细胞裂解液裂解细胞,从细胞中游离出来的DNA分子被吸附到磁性颗粒表面,蛋白质等分子不被吸附而留在溶液中。在磁场作用下,磁性颗粒与液体分开,回收颗粒,再用纯水或TE洗脱吸附的DNA。
6.硅珠提取法:在高浓度的硫氰酸胍的存在下,DNA被二氧化硅特异性地吸附,被吸附的DNA在没有硫氰酸胍存在下,DNA又从二氧化硅中释放出来。硫氰酸胍是高性能蛋白变性剂,可使蛋白质与DNA分离,在硅珠吸附前高速离心可去除变性的蛋白质等不溶物,吸附后的漂洗可去除溶液中PCR抑制物,DNA回收率高。
二、半自动提取。 通常使用半自动提取仪,本文以南京微略MW-AP48核酸纯化仪为例。特点如下:
1.适用范围广:对全血、血卡、唾液卡、人体骨骼、组织、精斑、接触性生物检材等多种生物样本均可分离出高质量核酸。
2.外形和内部设计:设计小巧,注重细节,外形美观兼顾实用,给实验室操作者带来不一样的体验,采用图形化用户界面、触控操作,可以新建、编辑和删除程序,内部可储存多个程序,方便不同检材的提取参数设置,并且实验舱内含有紫外消毒,避免再次提取时样本污染。
3.分离系统:磁性分离系统由磁棒与磁套组成。
4.快速便捷:具有独立温控加热槽,带紫外灭菌装置,采用直线电机,能带动磁力棒迅速对样本搅拌和混匀,整个提取时间20~30分钟,相当快速。还使用羟基磁珠,优化了裂解缓冲条件,较硅珠法DNA回收效率提高1倍以上。
5.独立的配套试剂盒:包含手工提取使用的蛋白酶K、DTT和磁珠提取全套试剂,一个盒子满足全套服务。
6.样品通量:1~48道,可以一次性处理48个样品,处理体积20μL~1000μL, 操作灵活简便,
操作步骤如下:将处理好的检材移入核酸提取仪配套预封装试剂96孔深孔板中的样本孔,打开仪器舱门,放入96深孔板和搅拌套,关闭舱门后启动提取仪,提取仪首先可以对样本加热升温进行细胞裂解,然后由磁棒和搅拌套来吸附磁珠并移至样本孔,待磁珠上吸附了裂解释放的核酸后,再通过磁棒和搅拌套将磁珠转移至清洗孔。 核酸提取制备的整体步骤:
之后,将提取好的DNA加入到96孔板对应孔中,再添加检测试剂,具体方法按各厂家试剂盒说明书使用方法进行配置添加。试剂添加完毕后,使用封膜机将96孔板封上,然后放置到扩增仪上进行扩增,扩增程序按各厂家检测试剂盒说明书上的扩增步骤进行设置,扩增时间按检测试剂盒扩增时间算,扩增完成后经传递窗口将样本传递至测序室。测序室配置好相应的试剂耗材,将扩增产物加入相应的试剂耗材中,使用测序仪上样电泳,待测序完毕后导出检测图谱,进行图谱分析,便可以获得嫌疑人或被害人DNA信息。
三、全自动提取
全自动核酸提取仪相对前两者更加方便快捷,可实现放入检材取出后直接扩增DNA,目前市面上已有多款产品,但设备价位较高是最大的限制因素。
亲子鉴定一般采用的是Chelex-100提取法提DNA。