亲子鉴定之荧光标记测序技术特点

      基本原理是双脱氧末端终止法，标记物选择荧光染料。荧光染料标记有2种方法：一种是标记引物，另一种是标记终止物ddNIP。荧光染料标记引物，操作方法相对复杂，如果选用一种荧光染料标记，则要分A、c、G、T四个单独的测序反应，然后再分别上样分析。如果用四种染料分别标记引物，按双脱氧ddNIP的不同分A、c、G、T四个单独的测序反应，上样时可将四个测序反应产物混合，合并在一个泳道内电泳，因此，荧光标记终止物ddNIP测序更有优势。将四种荧光染料分别标记在四种终止物ddNIP上，一个反应管内畏口可完成测序反应，操作简单、快速，对引物的选择、设计无特殊要求。该项技术的特征是测序反应后每一引物链延伸产物都因ddNIP标记物带有不同荧光染料，可在同一个泳道上样，经电泳分离后依据颇色将不同荧光波长特征性的谱带分开，同时激光检测器同步扫描，激发出的荧光经光栅分光后CCD(charge coupled device)摄像机上同步成像，再传人电脑，经软件分析可区别不同荧光区带，并确定靶片段的碱基序列。四色荧光染料标记终止物ddNTP的方法具有以下特点：①四个测序反应产物可以安排在一个泳道内电泳，避免了多个加样泳道间迁移率差异对精确度的影响。一次电泳分析的样品数可达36个或48个，改进电泳设备甚至可同时分析96个样品，检测效率明显提高。②技术方法简化，准确性高，序列结果稳定，克服了同位素标记方法的放射性污染缺点。③灵敏度高，极少量的PCR扩增产物如30ng就可以满足模板线性扩增的需要，获得足够量的序列分析产物，产生足够强的荧光信号。④测序能力强，速度快，高达200bp／J、时，36cm长的凝胶板可以准确测定900个碱基。⑤电泳分离自动化，应用DNA分析软件自动收集、处理和分析数据，大大降低了人工操作的劳动强度。⑥实验结果自动存储在计算机内，而且可以应用软件系统对资料作快速的查询。
      目前，已报道的荧光染料很多，PE公司产品主要有两种试剂盒，其他公司如Pharmacia公司的测序试剂盒，选用的荧光染料与PE公司基本相同。
      (1) Dye Temunation Cycle Sequencing Terminator kit (P/N402078)
FS测序试剂盒，四色荧光标记物为Rll0、R6G、ROX、TAMRA，引物浓度一般为3.2pmol，反应体积为20til。
      (2) BigDye Termination Cycle Sequencing Terminator kit (P/N4303152)
BigDye测序试剂盒采用的四色荧光标记物为：dR6G、dRll0、dTAMRA、dROX，引物浓度一般为3 .2pmol，反应体积为20vl。
      荧光标记对靶DNA片段直接测序反应的聚合酶，多是利用Taq DNA聚合酶。PE公司的测序试剂盒提供的酶类既有AmpliTaq DNA聚合酶，又有修饰过的T7 DNA聚合酶。Ampli TaqDNA聚合酶是一种超纯的热稳定聚合酶，为E．coli Taq DNA聚合酶经过修饰表达的产物，具有快速掺入核苷酸的特点。该酶没有3L5’外切酶的活性，耐94~ 96℃的高温，因此，是PCR循环测序较理想的聚合酶。应用Ampli Taq DNA聚合酶循环测序具有以下特点：
      (1)灵敏度高，对DNA模板量的要求较少，例如测定PCR产物序列仅需30ng模板量则可满足模板线性扩增的需要，能够获得足够量的序列分析产物，产生足够强的荧光信号：
      (2)可直接对单链、双链DNA模板及PCR产物进行测序，不需要对双链DNA变性，三种测序模板可采用相同的测序方案。但比较起来，对双链的PCR直接测序效果较好。
      (3)较高的反应温度减少了二级结构对序列测定的影响，使引物链能够更完全的延伸。
      (4)高温变性、退火减少了模板与引物间非特异性退火的机会，提高测序反应特异性：