DNA亲子鉴定-DNA甲基化-相关知识-北京科鉴基因中心

DNA甲基化(DNA methylation)是常见的表观遗传现象，它是指在DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的作用下，将甲基添加在DNA分子中的碱基上(Feinberg，2001)。研究发现，一个遗传完全一致的小鼠品系其皮肤却具有不同颜色，是基因的甲基化程度差异造成的。给怀孕母鼠进食富含甲基的食物时，引起了其基因表达模式的改变，使黄色的肥胖母鼠产下了标准褐色的健康体瘦仔鼠，并且这种皮毛颜色的性状差异往往由母鼠传递给后代。

常见的DNA甲基化发生在DNA链上胞嘧啶第5位碳原子和甲基间的共价结合，胞嘧啶由此被修饰为5一甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mC)。哺乳动物基因组DNA中5-mC约占胞嘧啶总量的2%～7%，约70%的5-mC存在于CpG二联核苷。在结构基因的5 7端调控区段，CpG二联核苷常常以成簇串联的形式排列，这种富含CpG二联核苷的区域称为CpG岛(CpG island)，其大小为500～lOOobp，约56%的编码基因含该结构（郑志红和孙开来，2002）。CpG具有以下特征。①CpG主要位于基因的启动子区．少量位于基因的第一个外显子区。②CpG岛一般是非甲基化的。看家基因的启动子都含CpG岛，且保持非甲基化状态，组织特异性基因则缺乏这样的岛。哺乳动物基因有两种启动子，即富含CpG序列且保持非甲基化状态的启动子和CpG含量较少、在大多数组织中甲基化的启动子，后一种总是出现在组织特异性表达的基因内，其表达活性受到调控且在大多数组织中被抑制。③启动子区的CpG甲基化可直接导致相关基因的表观遗传学基因沉默，而基因下游，即非岛区CpG的甲基化不抑制基因的转录。目前认为基因调控元件（如启动子）的CpG岛中发生5-mC的修饰会在空间上阻碍转录因子复合体与DNA的结合，因此，DNA甲基化一般与基因沉默相关联，而非甲基化一般与基因的活化相关联。基因在甲基化后去甲基化( demeth-ylation)则往往与一个沉默基因的重新激活相关联。④启动子区CpG甲基化的密度与转录的抑翻程变相关．弱的启动子能被密度较低的甲基化完全抑制，当启动子被增强子增强时，霞恢复转录功能，但如果甲基化的密度进一步增加，转录就又会被完全抑制。

DNA的甲基化分为维持性甲基化和构建性甲基化。维持性甲基化是指在甲基化的DNA模板指导下使新舍成的链甲基化。当一个甲基化的DNA双链复制时，新合成的DNA双链呈半甲基化，即保留链含有完整的甲基化标记，新生链呈非甲基化状态。这时，在Dnmtl的作用下，以保留链的甲基化位置为指导进行甲基化修饰。进一步的研究显示这种复制并不非常精确，每次细胞分裂中只有95%的CpG位点被还原出来。但是，即使一些特定的二核苷甲基化状态没有被复制出来，CpG岛的状态（甲基化／非甲基化）却会被可靠地复制下来。这对于基因印记中DNA甲基化模式的维持是非常重要的。DNA甲基化型在DNA复制中的维持机制也是重要的表观遗传学机制。

构建性甲基化是指无需模板指导完成的甲基化修饰，它由不依赖半甲基化DNA分子中的甲基化模板链从头开始合成5-mC的从头甲基化酶催化，如Dnmi 3a和Dnmt 3b。例如，在哺乳动物胚胎形成的初期，基因组中的DNA会安生云甲基化，随后，会在重新甲基化作用之下恢复到正常的甲基化水平，这种从头合成DNA甲基化的机制是什么？有一个观点认为，DNA区域的可触及性可以决定DNA甲基化的位置，因为DNA甲基转移酶并不能平均地接触到基因组任一位点，如结构紧凑的异染色质或失活的X染色体就很难触及。改变染色质局部结构的转录起始因子（如SNF2和染色质重构因子等）会影响DNA甲基化模式。也有观点认为，DNA序列自身决定了甲基化的目标。甲基化从某一个中心开始延伸，到将甲基化／非甲基化分界的CpG岛，甲基化的起始中心DNA具有重复序列，但确切的分子机制还不清楚。此钋，也可能是特殊的DNA结构、RNA干扰和类似通过RNA分子识别RNA和D\A的机制启动了甲基化过程：

此外，哺乳动物基因组DNA甲基化型还涉及DNA去甲基化酶(DNA demethylase)的作用。去甲基化包括非特异性去甲基化和特异性去甲基化。体外试验表明，去甲基化过程是在去甲基化酶的作用下利用核苷酸切除和连接而进行的核酸替代过程，并受RNA分子的调控。非特异性去甲基化发生在胚胎早期的植入期前，这时整个基因组发生了普遍的非特异的去甲基化过程。特异性的去甲基化具有组织和阶段的特异性，最早发生在植入期，大部分基因经历了重新甲基化过程，只有CpG岛未被甲基化，这可能是通过这种特异性去甲基化实现的。这一阶段的去甲基化酶活性的激活受锚定在CpG岛特异位点的蛋白质的影响，由反式作用因子识别基因附近的顺式调节元件来调控，另外，在个体生长发育过程中特异性的基因被激活也可能与该调控机制相关。

在表观遗传学的研究中，DNA的甲基化直接制约基因的活化状态，在生命过程中扮演着非常重要的功能。一方面，DNA甲基化与高等生物的生长发育密切相关，胚胎在发育和分化过程中，DNA序列一般不改变，但在特异性组织和器官中基因袁达有特定的模式，这和DNA甲基化有密切关系。相同类型细胞之间存在高度保守的甲基化模式，而同一器官的不同类型的细胞中甲基化模式是不同的。甲基化模式建立于配子形成期，并在发育进程中不断变化，通过甲基化、去甲基化维持甲基化模式的动态平衡。另一方面，DNA甲基化与肿瘤的发生发展也有着极其重要的关系。肿瘤组织的基因组中普遍存在的低甲基化和局部区域

的高甲基化现象，其分子机制还不清楚。目前的研究表明肿瘤相关基因的异常甲基化在肿瘤形成上起着重要的乍同：Bemol etal.，2003）。肿瘤抑制基因、肿瘤转移抑制基因、激素受体基因、DNA簟复基因和血管生成抑制基因等启动子区的过甲基化都可使相应基I表达下曩袁不表达。例如，pl6编码依赖于细胞周期蛋白的蛋白激酶抑制剂．在莹镪颦塞胃期中具有重要作用，在肺癌、乳腺癌和结肠癌中都发现了p15寓动子鹃过甲基化和P16蛋白的异常表达。在肿瘤形成过程中，这些表观遗传性改变与遗传性改变( DVA序列改变)相互作用，最终导致肿瘤的发生：另外．甲基他的毫毫啶容易自发脱掉氨基变成胸腺嘧啶，因而导致基因突变率增加。单核苷酸多态和基因突变中常检测到CpG-*TpG的转变。倒如，皮肤癌中常见到C-*T或CC一TT的突变，在日光下暴露的细胞，甲基化的胞嘧啶形成嘧啶二聚体的概率比非甲基化的高5～15倍，表明甲基化提供了外因诱发肿瘤发生的内在机制。另外，随着年龄的增长，CpG岛的甲基化不断增加，从而使年龄成为一些肿瘤发病的危险因素。这些都说明甲基化和甲基化模式的异常在肿瘤的发生中扮演非常重要的功能，因此，近年来从甲基化的角度研究肿瘤的发生成为研究的热点。

此外，DNA甲基化和其他生命过程也有重要的联系，如雌性哺乳动物的X染色体失活，能很好地实现体内X染色体上基因表达剂量的平衡；看家基因的低甲基化，使其具有持续的表达活性；印记基因的高甲基化，使其具有不同于经典孟德尔遗传的方式；而转座子、病毒基因组的甲基化则是机体的天然防御体系等。可见，DNA甲基化在生命过程中扮演了非常重要的角色。

DNA甲基化与基因沉默密切相关，但是DNA甲基化可能不是基因沉默的原因，而可能是其结果。例如，逆转录病毒的基因在感染后2天就被关闭，而相应启动子直到15天之后才被甲基化。类似地，失活X染色体中的沉默基因也是在关闭之后才被甲基化，而不是相反。从时间上看，往往先基因沉默，然后出现甲基化现象。～般认为甲基化机制是用来标识沉默基因的，而从发育早期开始，体细胞中很多基因启动子区域的甲基化对不可逆的基因沉默是必需的。含有DNA甲基转移酶的蛋白复合物能识别修饰过的H3-K9核小体组蛋白(Ulrey et a1．，2005)。甲基化能防止转录因子与启动子区域结合，并同时向结合蛋白发出信号，使其协同抑制基因表达。